農用微生物菌劑（GB 20287-2006）

前    言

本標準的5.1、5.3和第8章條文為強制性條款，其余為推薦性條款。

本標準的附錄A、附錄C和附錄D為規范性附錄，附錄B為資料性附錄。

　

農用微生物菌劑

1　范圍

本標準規定了農用微生物菌劑（即微生物接種劑）的術語和定義、產品分類、要求、試驗方法、檢驗規則、包裝、標識、運輸和貯存。

本標準適用于農用微生物菌劑類產品。

2　規范性引用文件（略）

3　術語和定義（略）

4　產品分類

產品按劑型可分為液體、粉劑、顆粒型；按內含的微生物種類或功能特性可分為根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類微生物菌劑、硅酸鹽微生物菌劑、光合細菌菌劑、有機物料腐熟劑、促生菌劑、菌根菌劑、生物修復菌劑等。

5　要求

5.1　菌種

    生產用的微生物菌種應安全、有效。生產者應提供菌種的分類鑒定報告，包括屬及種的學名、形態、生理生化特性及鑒定依據等完整資料。生產者應提供菌種安全性評價資料。采用生物工程菌，應具有允許大面積釋放的生物安全性有關批文。

5.2　產品外觀（略）

5.3　產品技術指標

5.3.1　農用微生物菌劑產品的技術指標見表1，其中有機物料腐熟劑產品的技術指標按表2執行。

                   表1  農用微生物菌劑產品的技術指標

項   目		劑  型
		液 體	粉 劑	顆 粒
有效活菌數(cfu)a  ，億/g(mL)	≥	2.0	2.0	1.0
霉菌雜菌數，個/g(mL)	≤	3.0×106	3.0×106	3.0×106
雜菌率， %	≤	10.0	20.0	30.0
水分，%	≤	-	35.0	20.0
細度，%	≥	-	80	80
pH值		5.0~8.0	5.5~8.5	5.5~8.5
保質期b，月	≥	3	6
a 復合菌劑，每一種有效菌的數量不得少于0.01億/g(mL)；以單一的膠質芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus）制成的粉劑產品中有效活菌數不少于1.2億/g。 b 此項僅在監督部門或仲裁雙方認為有必要時檢測。

 

                 表2  有機物料腐熟劑產品的技術指標

項目		劑   型
		液 體	粉 劑	顆 粒
有效活菌數(cfu)， 億/g(mL)	≥	1.0	0.50	0.50
纖維素酶活a，U/g（mL）	≥	30.0	30.0	30.0
蛋白酶活b，U/g(mL)	≥	15.0	15.0	15.0
水 分，%	≤	-	35.0	20.0
細 度，%	≥	-	70	70
pH值		5.0～8.5	5.5～8.5	5.5～8.5
保質期c，月	≥	3	6
a 以農作物秸稈類為腐熟對象測定纖維素酶活。 b 以畜禽糞便類為腐熟對象測定蛋白酶活。 c 此項僅在監督部門或仲裁雙方認為有必要時檢測。

 

 

5.3.2　農用微生物菌劑產品中無害化指標見表3。

            表3  農用微生物菌劑產品的無害化技術指標

參數		標準極限
糞大腸菌群數，個/g(mL)	≤	100
蛔蟲卵死亡率，%	≥	95
砷及其化合物（以As計），mg/kg	≤	75
鎘及其化合物（以Cd計），mg/kg	≤	10
鉛及其化合物（以Pb計），mg/kg	≤	100
鉻及其化合物（以Cr計），mg/kg	≤	150
汞及其化合物（以Hg計），mg/kg	≤	5

6　試驗方法

6.1　儀器設備（略）

6.2　試劑（略）

6.3　產品參數的檢測

6.3.1　外觀(感官)的測定

取少量樣品放到白色搪瓷盤(或白色塑料調色板)中，仔細觀察樣品的顏色、形狀、質地。

6.3.2　有效活菌數的測定

采用平板計數法，根據所測微生物的種類選用適宜的培養基。

若采用最大可能數（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照附錄C的規定。

6.3.2.1　系列稀釋

稱取樣品10 g（精確到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL的無菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無菌水中)，靜置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即成母液菌懸液（基礎液）。

用無菌移液管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45 mL無菌水中，按1:10進行系列稀釋，分別得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀釋的菌懸液（每個稀釋度應更換無菌移液管）。

6.3.2.2　加樣及培養

每個樣品取3個連續適宜的稀釋度，用無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，加至預先制備好的固體培養基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。

每一稀釋度重復3次，同時以無菌水作空白對照，于適宜的條件下培養。

6.3.2.3　菌落識別

根據所檢測菌種的技術資料，每個稀釋度取不同類型的代表菌落通過涂片、染色、鏡檢等技術手段確認有效菌。當空白對照培養皿出現菌落數時，檢測結果無效，應重做。

6.3.2.4　菌落計數

以出現20~300個菌落數的稀釋度的平板為計數標準（絲狀真菌為10~150個菌落數），分別統計有效活菌數目和雜菌數目。當只有一個稀釋度，其平均菌落數在20～300個之間時，則以該平均菌落數計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在20～300個之間時，應按兩者菌落總數之比值決定。若其比值小于等于2應計算兩者的平均數；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數計算。有效活菌數按式（1）或式（2）計算：

             nm = kv1/(m0v2) ×10-8                              …………………（1）

           

nv = kv1/(v0v2) ×10-8                                …………………（2）

 

式中：

nm — 質量有效活菌數，         億/g

          nv — 體積有效活菌數，         億/mL

          — 菌落平均數，             個

k — 稀釋倍數

v1 — 基礎液體積，             mL

v2 — 菌懸液加入量，           mL

v0 — 樣品量，                 mL

m0 — 樣品量，                 g6.3.3　霉菌雜菌數的測定

采用馬丁培養基，測定方法同6.3.2。

6.3.4　雜菌率的測定

除樣品有效菌外其它的菌均為雜菌。樣品中雜菌率按式（3）計算：

              m = n1/(n1+n)×100                              …………………（3）

式中：

m — 樣品雜菌率，             %

            n1 — 雜菌數，                億/g(mL)

            n — 有效活菌數，            億/g(mL)

6.3.5　水分的測定

將空鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃烘干 0.5 h，冷卻后稱量記錄空鋁盒的質量。然后稱取2份平行樣品（顆粒型樣品，應先粉碎過1.0 mm試驗篩），每份20 g（精確到0.01 g），分別加入鋁盒中并記錄質量。將裝好樣品的鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃下烘干4 h~6 h。取出置于干燥器中冷卻20 min后進行稱量。水分含量按式（4）計算（結果為兩次測定的平均值）：

         w = (m1- m2)/( m1- m0) ×100                    …………………（4）

式中：

w — 樣品水分含量，           %

m0 — 空鋁盒的質量，           g

m1 — 樣品和鋁盒的質量，       g

m2 — 烘干后樣品和鋁盒的質量， g

6.3.6　細度的測定

6.3.6.1　粉劑樣品

稱取樣品50 g（精確到0.1 g），放入300 mL燒杯中，加200 mL水浸泡10 min~30 min后倒入孔徑0.18 mm的試驗篩中，然后用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出清水為止。將試驗篩連同篩上樣品放入干燥箱中，在105 ℃±2 ℃烘干4 h ~6 h。冷卻后稱量篩上樣品質量。樣品細度按式（5）計算：

s  ={1- m1/[ m0（1-w）]} ×100                   …………………（5）

 

式中：

s  — 篩下樣品質量分數，     %

m0  — 樣品質量，             g

w   — 樣品含水量，           %

m1  — 篩上干樣品質量，       g

6.3.6.2　顆粒樣品

稱取樣品50 g（精確到0.1 g），將兩個不同孔徑的試驗篩（1.0 mm和4.75 mm）摞在一起放在底盤上(大孔徑試驗篩放在上面)。樣品倒入大孔徑試驗篩內篩樣品，然后稱小孔徑試驗篩上的樣品質量。顆粒細度按式（6）計算：

         g = m1 /m0 ×100                                         …………………（6）

式中：

g — 樣品質量分數，          %

m1 — 小孔徑試驗篩上樣品質量，g

m0 — 樣 品 質 量，           g

6.3.7　pH值的測定

打開酸度計電源預熱30 min，用標準溶液校準。

pH值的測定，每個樣品重復三次，計算三次的平均值。

6.3.7.1　液體樣品

用量筒取40mL樣品放入50 mL的燒杯中，直接用酸度計測定，儀器讀數穩定后記錄。

6.3.7.2　粉劑樣品

稱取樣品15 g，放入50 mL的燒杯中，按1:2(樣品:無離子水)的比例將無離子水加到燒杯中(如果樣品含水量低，可根據基質類型按1:3~1:5的比例加無離子水)，攪拌均勻。然后靜置30 min，測樣品懸液的pH值，儀器讀數穩定后記錄。

6.3.7.3　顆粒樣品

樣品先研碎過1.0 mm試驗篩，按照6.3.7.2的方法測定。

6.3.8　糞大腸菌群數的測定

應符合GB/T 19524.1《肥料中糞大腸菌群的測定》的規定。

6.3.9　蛔蟲卵死亡率的測定

應符合GB/T 19524.2《肥料中蛔蟲卵死亡率的測定》的規定。

6.3.10　纖維素酶活、蛋白酶活的測定

應符合附錄D的規定。

6.3.11　砷、鎘、鉛、鉻、汞的測定

應符合GB 18877—2002中的5.12~5.17的規定。

6.3.12　保質期的檢驗

在產品說明書標明的保質期前，按6.3.1~6.3.11方法測定產品相應指標。

7　檢驗規則

本標準中產品技術指標的數字修約應符合GB 8170的規定；產品質量合格判定應符合GB 1250中修約值比較法的規定。

7.1　抽樣

按每一發酵罐菌液（或每批固體發酵）加工成的產品為一批，進行抽樣檢驗，抽樣過程嚴格避免雜菌污染。

 

7.1.1　抽樣工具

無菌塑料袋(瓶)，金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、抽樣封條及抽樣單等。

7.1.2　抽樣方法和數量

一般在成品庫中抽樣，采用隨機法抽取。

抽樣以件為單位，小包裝以每一包裝箱為一件。隨機抽取3~5件，每件中隨機抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包裝小于500 g（mL）的產品，應多抽幾件。大包裝產品以一袋(桶)為一件，隨機抽取5~10件，在無菌條件下，每件取樣500 g(mL)，然后將抽取樣品混勻，按四分法分裝3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500 g(mL)。

7.2　檢驗分類（略）

7.3　判定規則

7.3.1　具下列任何一條款者，均為合格產品

a. 檢驗結果各項技術指標均符合標準要求的產品；

b. 在產品的外觀、水分、細度、pH值等檢測項目中，有1項不符合要求，而其它各項技術指標符合要求的產品。

7.3.2　具下列任何一條款者，均為不合格產品

a. 有效活菌數不符合技術指標；

b. 霉菌雜菌數不符合技術指標；

c. 雜菌率不符合技術指標；

d. 糞大腸菌群不符合技術指標；

e.     蛔蟲卵死亡率不符合技術指標；

f. 砷、鎘、鉛、鉻、汞中任一含量不符合技術指標；

g. 有機物料腐熟劑產品中所測酶活不符合技術指標；

h. 在外觀、水分、細度、pH值等檢測項目中，有2項（含）以上不符合要求。

8　包裝、標識、運輸和貯存

    參見NY 885-2004《農用微生物產品標識要求》

 

　

附　錄　A   常用檢測培養基

　

    參見NY/T 1114-2004《微生物肥料實驗用培養基技術條件》

　

附　錄　B
（資料性附錄）
常用染色劑

B.1　革蘭氏染色劑

B.1.1　結晶紫染色液（Hucker氏配方）

甲液：結晶紫（Crystal violet）       2.0 g

      乙醇(95%)                      20.0 mL

乙液：草酸銨[(NH4)2C2O4•H2O]             0.8g

      蒸餾水                         80.0 mL

甲、乙兩液相混，過濾，棕色瓶保存。

B.1.2　盧哥(Lugol)氏碘液

碘(I2)片                            1.0 g

碘化鉀(KI)                          2.0 g

蒸餾水                              300 mL

先溶碘化鉀于少量蒸餾水中，再將碘溶于碘化鉀溶液中，可稍加熱，最后加足蒸餾水，棕色瓶保存。

B.1.3　脫色液  95%的乙醇液。

B.1.4　復染液  0.5%的番紅水溶液（Safranin O)

2.5%的番紅酒精溶液                  20 mL

蒸餾水                              80 mL

B.2　芽胞染色液

B.2.1　孔雀綠染色液（Malachite green）

孔雀綠                             5.0 g

蒸餾水                            100 mL

B.2.2　0.5%番紅染色液

B.3　石碳酸復紅染色液

甲液：堿性復紅(Basic fuchsin)     0.3 g

       95%酒精                     10.0 mL

乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P)  5.0 g

       蒸餾水                      95 mL

將甲、乙兩液混合后即得石碳酸復紅染色液原液。染色時，將原液稀釋5~10倍使用。

 

　

附　錄　C
（規范性附錄）
稀釋法（MPN 5管法）

C.1　稀釋

稱取樣品10.0 g，加入帶玻璃珠的100 mL的無菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無菌水中)，靜置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即得到1×101稀釋度的菌懸液。

用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀釋度的菌懸液（每個稀釋度應更換無菌移液管）。

C.2　加樣

選擇適宜的5個連續稀釋度，用無菌移液管分別吸取不同稀釋度的菌懸液1.0 mL，加到已準備好的盛有9.0 mL無菌培養基的螺口試管中，每一稀釋度重復接5支試管（不同稀釋度間更換無菌移液管），同時用無菌培養液作對照。

C.3　培養

接種后立即擰緊塑料帽并搖勻，將接種好的試管放到適宜的條件下培養。

C.4　計算

根據各稀釋系列試管中有無待測微生物生長或其生理反應的正或負得出數量指標，并在相應的MPN統計表中查出近似值（見表C1），即可計算出待測樣品的有效活菌數，以億個/mL或億個/g表示。

計算方法：

1mL（g）樣品中的有效活菌數=菌數近似值×數量指標第一位數的稀釋倍數

C.5　計數規則

在稀釋系列中必須最后一個稀釋度所有重復間都沒有微生物生長。確定數量指標系取稀釋系列中所有重復都有生長(或是正反應)的最高稀釋度為數量指標的第一位數字，總共取三個連續稀釋管的結果查表。

C.5.1　在全部5支試管中均出現生長的稀釋度中，把出現生長的稀釋度倍數最高的那一級放入數列。例如：為5-5-3-0-0時，則取5-3-0數列；

C.5.2　在全部5支試管中均不出現生長的稀釋度中，把稀釋度倍數最低的那一級放入數列。例如：為5-3-0-0-0時，則取5-3-0數列；

C.5.3　如果應用上述兩條規則，會出現采用如5-5-4-3-0這樣的4個等級的稀釋度的情況。此時，可先取前面的5-4-3數列，后取4-3-0數列，分別求出lgMPN，然后算出其真數的平均值。在此列中，數列5-4-3的lgMPN為1.447，數列4-3-0的lgMPN為0.431+1（后一數列與前一數列相應稀釋了10倍，故要加1進行校正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。

 

　

表C.1  MPN，lgMPN表

陽性試管數			MPN （相當于第一稀釋管1毫升）	LgMPN	陽性試管數			MPN （相當于第一稀釋管1毫升）	LgMPN
第一 稀釋管	第二 稀釋管	第三 稀釋管			第一 稀釋管	第二 稀釋管	第三 稀釋管
0	0	0	0	-	5	0	0	2.3	0.362
0	1	0	0.18	0.255-1	5	0	1	3.1	0.491
1	0	0	0.20	0.301-1	5	1	0	3.3	0.519
1	1	0	0.40	0.602-1	5	1	1	4.6	0.663
2	0	0	0.45	0.653-1	5	2	0	4.9	0.690
2	0	1	0.68	0.833-1	5	2	1	7.0	0.845
2	1	0	0.68	0.833-1	5	2	2	9.5	0.978
2	2	0	0.93	0.968-1	5	3	0	7.9	0.898
3	0	0	0.78	0.892-1	5	3	1	11.0	1.041
3	0	1	1.1	0.041	5	3	2	14.0	1.146
3	1	0	1.1	0.041	5	4	0	13.0	1.114
3	2	0	1.4	0.146	5	4	1	17.0	1.230
4	0	0	1.3	0.114	5	4	2	22.0	1.342
4	0	1	1.7	0.230	5	4	3	28.0	1.447
4	1	0	1.7	0.230	5	5	0	24.0	1.380
4	1	1	2.1	0.322	5	5	1	35.0	1.544
4	2	0	2.2	0.342	5	5	2	54.0	1.732
4	2	1	2.6	0.415	5	5	3	92.0	1.964
4	3	0	2.7	0.431	5	5	4	160.0	2.204
					5	5	5	>180.0	>2.255

 附　錄　D (略)